+
Prestin è espresso su tutta la superficie basolaterale delle cellule dei capelli esterno astratto Prestin è stato identificato come una proteina motore responsabile di cellule ciliate esterne (OHC) electromotility. Precedenti esperimenti hanno rivelato che OHC electromotility e la sua capacità non lineare associato risiedevano nella parete laterale OHC e non è stato rilevato al piatto cuticolare apicale e della regione basale. In questo esperimento, la distribuzione di prestin nel topo adulto, ratto, cavia e OHC è stato riesaminato mediante l'uso di immunofluorescenza colorazione e microscopia confocale. Abbiamo scoperto che l'etichettatura prestin era situato l'intera parete basolaterale OHC, tra cui la membrana plasmatica basale. Tuttavia, la colorazione a livello della membrana basale era debole. Rispetto al intensità alla parete laterale, le intensità di etichettatura prestin sulla membrana a livello nucleare e polo basale erano 80,5% e 61,1% rispettivamente. etichettatura Prestin non è stato trovato al piatto cuticolari e stereocilia. L'etichettatura prestin era anche assente nel citoplasma e nuclei. La parete laterale OHC sopra del livello nucleare è composto della membrana plasmatica, lattice corticali e sottosuolo cisterne. Con costaining con di-8-ANEPPS, etichettatura prestin fu trovato lo strato esterno della parete laterale OHC, che è stato ulteriormente dimostrato utilizzando una sfida ipotonico per separare la membrana plasmatica dal cisternae sottosuolo sottostante. I dati hanno rivelato che prestin si esprime in tutta la membrana basolaterale OHC. Prestin nella membrana plasmatica basale può fornire un serbatoio sulla superficie OHC per prestin-riciclaggio e può anche facilitare svolgere la sua funzione trasportatore ipotizzato. Parole chiave: Electromotility, membrana plasmatica Coclea, la meccanica attivi, di-8-ANEPPS 1. Introduzione funzione uditiva mammiferi si basa sulla motilità attiva delle cellule ciliate esterne (OHCS) per aumentare la vibrazione membrana basilare (Brownell et al 1985;. Dallos, 1992). Il OHC ha una forma cilindrica; suo polo apicale ha la piastra cuticolare che stereocilia si trova, e suo polo basale contiene un nucleo e ha sinapsi collegate con i nervi uditivi. La parete laterale OHC ha un'organizzazione unica trilaminato sopra del livello nucleare e si compone di membrana plasmatica (PM), lattice corticale (CL), e sottosuolo cisterne (SSC) (flock et al 1986. Forge, 1991;. Forge et al. 1993; Holley e Ashmore, 1990; Holley et al 1992;. Oghalai et al 1998).. Il PM è lo strato più esterno della parete laterale. Il CL si trova sotto il PM ed è una struttura del citoscheletro orthotropically organizzata. La SSC è lo strato più interno, è composta di endoplasmatico laminati membranose (Saito, 1983). Il CL e SSC allineano la superficie citoplasmatica laterale della membrana plasmatica e terminano sopra del livello nucleare. Precedenti esperimenti hanno dimostrato che OHC electromotility risiedeva nella sua parete laterale (Dallos et al 1991;. Kalinec et al 1992;. Hallworth et al 1993;. Gale e Ashmore, 1997a). Patch clamp ha anche mostrato che il non lineare capacità motilità associata era piccolo e non rilevabile a livello della membrana subnucleare (Huang e Santos-Sacchi, 1993; Gale e Ashmore, 1997b). E 'stato ipotizzato che le proteine del motore non ha avuto la distribuzione nella membrana plasmatica di sotto del livello nucleare (Hallworth et al 1993;. Huang e Santos-Sacchi, 1993). Recentemente, prestin è stato identificato come una proteina motore responsabile OHC electromotility (Zheng et al 2000;. Liberman et al., 2002). Immunofluorescenza colorazione dei OHC per prestin nell'organo tutto il montaggio di Corti ha mostrato un modello di anello di etichettatura al confocale sezione di scansione ortogonale all'asse longitudinale OHC, indicando che prestin è espressa sulla superficie OHC (Belyantseva et al 2000;. Zheng et al 2001. 2003;. Adler et al 2003).. Tuttavia, la precisa distribuzione delle prestin sulla superficie OHC manca una descrizione dettagliata. In questo esperimento, abbiamo ri-esaminato l'espressione prestin in OHC mediante l'uso di immunofluorescenza colorazione e microscopia confocale con tutto l'epitelio preparazione di montaggio e preparazione cellulare dissociata singolo. Abbiamo scoperto che l'etichettatura prestin era visibile su tutta la parete basolaterale OHC. Nella parete laterale, forte etichettatura prestin era situato nella membrana plasmatica. 2. Risultati cellule ciliate esterne (OHC) hanno tre righe nella dell'epitelio sensoriale cocleare. Figg. 1A & # x02013; D mostrano immunofluorescenza colorazione OHC in situ per l'anti-prestin in tutto il montaggio di preparazione. etichettatura Prestin ha mostrato un modello di suoneria caratteristica ed è apparso 3 righe nella zona OHC. Tuttavia, non vi era alcuna etichettatura trovato nella cella di capelli interna e sostenere superficie cellulare (Figg 1A & # x02013;. D). Questa colorazione negativa servito da un buon controllo interno per la specificità della colorazione a Prestin. Figg. 1A & # x02013; C sono le immagini confocale seriali digitalizzate a diverse profondità Z a livello nucleare OHC. I nuclei cellulari sono stati rivelati da co-colorazione con DAPI. Mentre la sezione di scansione stava andando verso il basso, i nuclei del 1 °, 2 ° e 3 ° fila OHC conseguenza apparivano e scomparivano poi (Fig 1A & # x02013;. C). etichettatura Prestin era chiaramente visibile a livello nucleare e circondato i nuclei. Figura. 1D è la sezione trasversale ottica di immagine confocale. etichettatura Prestin potrebbe essere visto lungo la parete laterale OHC dall'alto in basso anche a livello nucleare (indicato dalle frecce in Fig. 1D). Una freccia in un inserto in Fig. 1D indica etichettatura prestin al polo basale. Immunofluorescenza colorazione delle cellule cavia esterni capelli (OHCS) per prestin in situ in preparazione e in preparazione delle cellule dissociata tutto il montaggio. (A & # x02013; C) Sezioni seriali di scansione confocale dell'epitelio sensoriale uditivo in tutto il montaggio di preparazione. . Al fine di rivelare l'espressione prestin sulla superficie OHC chiaramente, abbiamo esaminato immunofluorescenza colorazione di OHC dissociate per anti-prestin. Figg. 1E e F etichettatura spettacolo prestin in un OHC dissociato. etichettatura Prestin era visibile l'intera membrana basolaterale, compresa la membrana subnucleare a livello nucleare e polo basale. Tuttavia, non vi era alcuna etichettatura prestin al piatto cuticolare apicale (Fig. 1E) e una cella di supporto collegato (indicato da una freccia in Fig. 1F), che è conosciuto come aventi alcuna espressione prestin. la distribuzione Prestin a livello della membrana subnucleare a livello nucleare e polo basale è stato trovato in tutta esaminato OHC (n & # x0003e; 100, gamma di lunghezza: 18 & # x02013; 80 & # x003bc; m). etichettatura Prestin alla membrana subnucleare era visibile anche in topi e ratti OHC (Fig. 2). Figg. 2A, C, ed E mostrano che la membrana basolaterale OHC avuto una forte etichettatura prestin ma stereocilia aveva alcuna etichettatura (indicata da una freccia in Fig. 2B). gambo s nelle figure; Una cella & # x02019 Deiters rotti. 2C e D avevano anche senza etichettatura prestin. etichettatura Prestin nella regione subnucleare OHC è stato trovato anche in topo e ratto epiteli in tutto il montaggio preparazione (dati non mostrati). colorazione immunofluorescenza di prestin nel topo e nel ratto OHC. OHC sono stati dissociato dal mouse o ratto coclea e sono stati colorazione per anti-prestin C-terminale. etichettatura Prestin è visibile a livello della membrana subnucleare, ma non a stereocilia e la cuticola. Immunofluorescenza di OHC per anticorpi Prestin N-terminale mostra lo stesso schema di etichettatura la colorazione anti-prestin C-terminale (Fig. 3). etichettatura Prestin stata osservata sulla superficie intera parete basolaterale OHC, ma assenti nel citoplasma e membrana nucleare (Figg. 3A e C). Al fine di verificare se anticorpo prestin penetrato attraverso la membrana plasmatica nel citoplasma, abbiamo utilizzato di-8-ANEPPS per co-macchiare le cellule. Il colorante di-8-ANEPPS è una membrana plasmatica tintura impermeabile etichettatura del doppio strato di fosfolipidi. Dopo la fissazione e il trattamento con Triton X-100 in immunofluorescenza, di-8-ANEPPS potrebbe passare attraverso la membrana plasmatica ed etichettato gli organelli membranosi citoplasmatici e la membrana nucleare (Fig. 3B). Tuttavia, non vi era alcuna colorazione prestin nel citoplasma e nel nucleo (Fig. 3A). Una freccia in Fig. 3C indicato che l'etichettatura prestin era situato a livello della membrana plasmatica separato invece della membrana nucleare al polo basale. Immunofluorescenza colorazione di un OHC per l'anti-prestin N-terminale. Pannello A è una immagine confocale di immunofluorescenza per prestin. Forte colorazione si trova sulla superficie della parete basolaterale delle cellule; non vi è alcuna etichettatura prestin nel citoplasma. etichettatura Prestin a livello della membrana subnucleare è apparso debole (Fig 1 & # x02013;. 3). Abbiamo analizzato quantitativamente distribuzione di etichettatura prestin sulla superficie OHC (Fig. 4). Le intensità di etichettatura prestin alla parete laterale, la membrana a livello nucleare e la membrana basale (vedi un inserto in Fig. 4A) sono stati misurati e normalizzati per l'intensità di colorazione della parete laterale in ciascuna cella. Nelle cellule dissociate, le intensità normalizzati a livello nucleare e membrana basale erano 80.49 & # x000b1; 3.72% e 61.11 & # x000b1; 5,55%, rispettivamente (Fig. 4A), ed erano significativamente inferiore a quella in corrispondenza della parete laterale (P & # x0003c 0,001, t test accoppiato). In tutto il montaggio di preparazione, l'intensità normalizzata dell'etichettatura prestin alla membrana subnucleare (la membrana a livello nucleare e polo basale) era 61.00 & # x000b1; 6,12% (Fig 4B.), Che era meno di 70.80 & # x000b1; 4,13% misurato nelle cellule dissociate, ma non vi era alcuna differenza statisticamente significativa tra di loro (p = 0,24, test t). L'analisi quantitativa della distribuzione membrana prestin sulla superficie OHC. (A) Distribuzione di espressione prestin sulla superficie OHC dissociato. Le intensità di etichettatura prestin sulla membrana a parete laterale, il livello nucleare e la. La parete laterale OHC è composto dal PM, CL, e SCC sopra del nucleo cellulare. The-ANEPPS di-8 dye etichettato il PM così come altre strutture membranose cellulari, tra SCC, reticolo endoplasmatico, e stereocilia, dopo fissazione e trattato con Triton X-100 (Fig. 5B). etichettatura Prestin sovrapposto di-8-ANEPPS colorazione nella parete basolaterale, ma non nel reticolo endoplasmatico e stereocilia (Fig. 5C). Ad alto ingrandimento (inserto in Fig. 5C), etichettatura prestin era presente il più esterno, molto probabilmente strato PM nella parete laterale OHC, ma era assente lo strato interno, che è stato indicato dalle frecce bianche vuote. L'espressione di prestin nella parete basolaterale OHC. Un OHC è stato co-macchiato per prestin e di-8-ANEPPS. Pannelli A e B sono immagini fluorescenti per etichettatura prestin e tintura di-8-ANEPPS colorazione rispettivamente. Panel C è una immagine fusa. etichettatura Prestin e. Per esaminare ulteriormente la localizzazione prestin nella parete laterale OHC, abbiamo applicato una soluzione ipotonica extracellulare per indurre OHC gonfia, il tentativo di separare il PM dalla SSC sottostante e CL (Oghalai et al. 1998). Una testa freccia nelle figure. 6A & # x02013; C ha indicato che sfida ipotonica cellulare indotta gonfio e formò una bolla sulla parete laterale OHC; forte etichettatura prestin era visibile sul bordo della bolla. Tuttavia, non vi era alcuna etichettatura prestin nel SSC sottostante. Ciò è coerente con precedenti relazioni che la proteina del motore OHC si trova all'interno della membrana plasmatica nella parete laterale OHC (Kalinec et al 1992;. Huang e Santos-Sacchi, 1994; Santos-Sacchi e Zhao, 2003). Figg. 6D & # x02013; F mostrano anche che, come la parete laterale è stato rotto dalla sfida ipotonica, etichettatura prestin era assente alla foce rottura (indicato dalle frecce). Co-colorazione dei OHC per prestin e di-8-ANEPPS con una sfida ipotonica. Le OHC isolate sono state incubate in una soluzione ipotonica prima della fissazione. (A & # x02013; C) immagini fluorescenti di un OHC per prestin e di-8-ANEPPS colorazione. Una punta di freccia indica. 3. Discussioni In questo esperimento, abbiamo scoperto che prestin è espresso su tutta la superficie basolaterale OHC. etichettatura Prestin era chiaramente visibile in corrispondenza della zona subnucleare in preparazione montaggio intero epitelio nonché in singola preparazione cellulare dissociata (Figg 1 e # x02013;. 6). Immunofluorescenza colorazione ha mostrato lo stesso schema di etichettatura per l'anti-prestin C-terminale e N-terminale anticorpi in tre specie diverse (cavia, ratto, e il mouse), e non aveva alcuna etichettatura nelle cellule ciliate interne e cellule di sostegno (Fig. 1 & # x02013; 3), che indica una elevata specificità di colorazione a Prestin. 3.1. L'espressione di prestin nella regione subnucleare OHC La distribuzione del prestin nella membrana subnucleare in OHC è incompatibile con la concezione precedente che la distribuzione di prestin è limitata alla membrana supernuclear della parete laterale OHC. E 'stato riportato che l'etichettatura prestin non era visibile a livello nucleare OHC nella epiteli sensoriali cocleare in tutto il montaggio preparato (al. Belyantseva et 2000). Tuttavia, i nuclei cellulari non sono stati dimostrati in questo esperimento. Così, la regione nucleare OHC non può essere determinato con precisione. In questo esperimento, i nuclei delle cellule sono state dimostrate da co-colorazione con DAPI. etichettatura Prestin era chiaramente visibile a livello nucleare e circondato i nuclei OHC in tutto il montaggio di preparazione (Figure 1A & # x02013;. C). etichettatura SUBNUCLEARE di prestin è stata ulteriormente dimostrata trasversale ottica sezione di immagine confocale in preparazione (Fig. 1D) tutto il montaggio. etichettatura Prestin a livello della membrana plasmatica subnucleare OHC potrebbe anche essere visto in sezione trasversale della coclea di ratto in dati precedentemente pubblicati (vedi figura 6 in Weber et al 2003;... figure 6A e 7A in Ruttiger et al., 2004). Così, prestin in situ ha una distribuzione subnucleare. Rispetto alla intensità etichettatura nella parete laterale OHC, tuttavia, la distribuzione prestin nella regione subnucleare era debole (Figg 1 e # x02013;. 3). L'analisi quantitativa ha dimostrato che in tutto il montaggio preparazione prestin colorazione nella membrana subnucleare aveva solo 61% dell'intensità della parete laterale (Fig. 4B). In situ, le estremità basali di OHC siedono sulle tazze di cellule Deiters e vengono incorporati per sinapsi formate con terminazioni nervose uditive. Questo potrebbe impedire l'accesso e l'anticorpo vincolante nella porzione basale OHC. Negli esperimenti, come il polo basale OHC aveva relitti delle membrane cellulari o terminazioni nervose coperti o allegate, l'etichettatura prestin apparso debole o assente (Figure 2C e D. & # x200B,., 3C, 3C & # x200B,., 5C ., 5C e & # x200B; and6F). 6F). D'altra parte, il polo basale OHC possiede anche un'alta densità di distribuzione canale ionico (Santos-Sacchi et al. 1997). Questo potrebbe escludere espressione prestin pure, con conseguente debole colorazione per prestin nella membrana basale OHC. Prestin potrebbe lateralmente diffondere fino a livello di nucleo dopo la dissezione. La diffusione laterale nella parete laterale OHC stato segnalato (Oghalai et al 2000;. Santos-Sacchi e Zhao, 2003). Per alcuni meccanismi sconosciuti, le proteine Prestin possono essere limitati in vivo e non potevano diffondere fino al livello di nucleo. La dissezione potrebbe rimuovere la restrizione permettendo proteine Prestin diffondenti fino al polo basale. Tuttavia, l'espressione prestin potrebbe essere visto nella regione basale OHC in situ in preparazione (.; D figure 1A & # x02013) tutto il montaggio. L'intensità della colorazione nella regione subnucleare in tutto il montaggio preparazione è stata un po 'meno in fase di preparazione delle cellule dissociata (Fig 1 & # x02013;. 3). L'analisi quantitativa ha dimostrato che non vi era alcuna differenza significativa (Fig. 4B), anche l'anticorpo può avere alcune restrizioni per l'accesso al polo basale OHC in situ. Così, il processo di dissociazione non ha contribuito in modo significativo alla Prestin espressione nella regione subnucleare. Nei OHC dissociati, etichettatura prestin è stato chiaramente dimostrato a livello della membrana subnucleare (Fig 1E e F e Fichi 2 & # x02013;.. 6). Tuttavia, la registrazione patch-clamp non riusciva a trovare o rilevare electromotility o capacità non lineare al polo basale nelle OHC dissociati (Dallos et al 1991;. Hallworth et al 1993;. Huang e Santos-Sacchi, 1993; Gale e Ashmore, 1997b ). Diverse ragioni potrebbero causare questa discrepanza. In primo luogo, perché l'espressione prestin nel polo basale è debole (Fig. 4), la capacità non lineare potrebbe essere troppo piccola per essere rilevata nella registrazione patch. In secondo luogo, poiché la regione subnucleare OHC manca la CL e strutture SSC, il movimento della membrana guidato da prestin può diventare piccolo e non rilevabile. E 'stato riportato che nelle cellule trasfezione Prestin movimento membrana cellulare è molto piccola e quasi impercettibile (al. Zheng et 2000). Infine, le proteine Prestin nel polo basale possono avere alcun & # x02018; funzione & # x02019; per electromotility. Recentemente, è stato trovato che prestin si esprime anche nelle cellule ciliate vestibolari di roditore saccule, utricolo, e ampollare crista, ma non ha electromotility e capacità non lineare (Adler et al. 2003). Così, nonmotility prestin può anche esistere nel cocleare polo basale OHC. 3.2. Possibili funzioni nonmotility di prestin nella regione subnucleare OHC Diverse funzioni nonmotility può essere ipotizzato per prestin localizzate a livello della membrana subnucleare. Innanzitutto, le proteine Prestin nella membrana subnucleare possono fornire un serbatoio nella parete basolaterale OHC. Recentemente, abbiamo riportato che prestin può essere regolata tramite la somministrazione di salicilato e può essere in continuo riciclo nel ciclo vitale (Yu et al. 2005). Prestin nella regione basale può prevedere un serbatoio per il riciclaggio prestin. In secondo luogo, prestin nella membrana basale può facilitare l'esecuzione di funzione di trasportatore. Recentemente, è stato ipotizzato che prestin può anche funzionare come un trasportatore oltre electromotility (Chambard et al. 2003). Il gene prestin appartiene ad un trasportatore di solfato / anione familiare e ha alta omologia con i membri della famiglia SLC26 di proteine di trasporto di anioni (Zheng et al. 2000. 2001). Il polo basale OHC possiede una elevata densità di canali ionici (Santos-Sacchi et al., 1997) e sinapsi formate dalle terminazioni nervose uditivo. Prestin trova nella membrana basale può svolgere funzione di teletrasporto più efficiente. Infine, è stato ipotizzato che prestin può giocare un ruolo importante nel rilascio di neurotrasmettitore recipiente (Brownell et al. 2001). espressione Prestin nella membrana basale fornisce una evidenza istologica per questa ipotesi, migliorando il rilascio dei neurotrasmettitori mediante amplificazione delle forze flexoelectricitical. 4. procedure sperimentali 4.1. Animali e la preparazione delle cellule dei capelli esterno Un totale di 21 porcellini d'India albini (200 & # x02013; 450 g), 3 Sprague & # x02013; Dawley (6 & # x02013; 8 settimane), e 10 topi CBA (6 & # x02013; 10 settimane) sono stati utilizzati in questo esperimento. Dopo l'iniezione di sovradosaggio di pentobarbital, gli animali sono stati decapitati e le ossa temporali sono stati rimossi. La capsula otica è stato dissezionato in una soluzione extracellulare standard (130 NaCl, 5,37 KCl, 1.47 MgCl 2 2 CaCl 2 25 destrosio, e 10 HEPES in mm;.. 300 mOsm e pH 7.2) per rivelare l'organo del Corti. Dopo le vascularis membrana e stria tectorial sono stati rimossi, l'epitelio sensoriale (organo del Corti) è stato raccolto via con un ago affilato. Gli epiteli isolati sono stati trasferiti in un piatto per la colorazione. Per la preparazione di cellule dissociate, gli isolati epiteli sensoriali sono state ulteriormente dissociate con l'enzima tripsina (1 mg / ml) per 5 e # x02013; 10 min. Le cellule dissociate sono state trasferite ad un piatto per la colorazione. Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in accordo con le politiche di Università del Kentucky & # x02019; s cura degli animali e del Comitato Usa. 4.2. anticorpi Prestin Due policlonale di coniglio anti-topo-prestin frammento C-terminale (Ab # 792) e frammento N-terminale (Ab # 802) anticorpi sono stati utilizzati in questo esperimento (gentile dono del Dr. Zheng, Northwestern University). La specificità di questi anticorpi è stato completamente caratterizzato e verificati in studi precedenti, anche in topi knockout Prestin (Zheng et al 2001. 2005;. Matsuda et al 2004).. In esperimenti successivi, abbiamo utilizzato anche altri due anti-Prestin anticorpi commerciali C-terminale e N-terminale (Cat #: SS-22694 e ss-22692, rispettivamente, Santa Cruz Biotechnology Inc. CA). Non c'era differenza trovata per tutti gli anticorpi anti-Prestin utilizzati in colorazione. 4.3. immunofluorescenza colorazione Il epiteli sensoriali cocleare sezionato o cellule cocleari dissociate sono state fissate con 4% paraformaldeide per 30 min. Dopo lavaggio con PBS 0,1 M per 3 volte, epiteli o cellule sono state incubate in una soluzione bloccante (10% siero di capra e 1% BSA in PBS) con 0,1% Triton X-100 per 20 min. Poi, epiteli o cellule sono state incubate con un anticorpo anti-prestin (1: 1000 e # x02013; 1500) nella soluzione bloccante a 4 e # x000b0; C durante la notte. In esperimenti di controllo, l'anticorpo anti-prestin è stato omesso. Dopo lavaggio con PBS per 3 volte, le cellule sono state fatte reagire a un Alexa Fluor 488 capra coniugato anti-IgG di coniglio (1:. 500; Cat> A11034 Molecular Probes.) Nella soluzione di saturazione a temperatura ambiente per 1 h. Per la co-colorazione con il colorante di-8-ANEPPS per dimostrare la membrana plasmatica e organelli citoplasmatici membranose, epiteli o cellule sono state ulteriormente incubate a 30 & # x003bc; M di-8-ANEPPS (D-3167, Molecular Probes Inc. Eugene, OR) per 2 & # x02013; 3 minuti dopo l'incubazione anticorpo secondario. Dopo completamente il lavaggio tintura con 0,1 M PBS, la colorazione è stata osservata al microscopio confocale. 4.4. Cellular colorazione nucleo I nuclei delle cellule sono state colorate con 4 & # x02032,, 6-diamidino-2-phenylin-Dole (DAPI, D1306, Molecular Probes). La soluzione stock di DAPI (5 mg / ml) è stato fatto con acqua deionizzata. Dopo la reazione al 2 anticorpi, pezzi di epiteli o cellule dissociate sono state incubate con una diluizione di 1:50 di soluzione DAPI a temperatura ambiente (23 & # x000b0; C) per 15 & # x02013; 30 min, e lavate con PBS per 3 volte. 4.5. Il microscopio confocale a scansione laser Gli epiteli o cellule colorate sono stati osservati sotto un microscopio confocale Leica (Leica TCS SP2) dotato di 100 & # x000d7; (NA 1.4) obiettivo di olio apochromatic. L'argon (488 nm) laser con 496 e # x02013; 530 nm e 630 & # x02013; 710 nm filtri di emissione è stato utilizzato per la visualizzazione di Alexa Fluor 488 e di-8-ANEPPS rispettivamente. La colorazione DAPI è stato visto da uso di un UV 2 fotoni con un 380 & # x02013; filtro di emissione 484 nm. 4.6. Analisi quantitativa della colorazione La colorazione immunofluorescenza di prestin in OHC è stato quantitativamente analizzata dal NIH software di immagine (Bethesda, MD). Le intensità di colorazione alla parete laterale OHC sopra del livello nucleare, a livello nucleare e sulla membrana basale pole stati misurati separatamente. Le intensità sono stati poi normalizzati per l'intensità di colorazione alla parete laterale e mediati. I dati sono stati presentati come media & # x000b1; SE. 4.7. sfida ipotonica Cellulare sfida ipotonica è stato ottenuto mediante l'applicazione di una soluzione extracellulare ipotonica. cellule dissociate sono state incubate in un 275 mOsm soluzione ipotonica extracellulare per 5 minuti prima del fissaggio. L'osmolarità soluzione venne regolato destrosio e misurato da un osmometro controllato microcomputer (Modello 3300, Advanced Instruments Inc. Norwood, MA). Ringraziamenti Siamo grati al Dr. Jing Zheng presso la Northwestern University per la fornitura di anticorpi anti-Prestin. Ringraziamo P. G. Wilson e Ni Ji per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da NIDCD DC 05.989 e tinnito Foundation Research Associate americano. Riferimenti Adler HJ, Belyantseva IA, Merritt RC, Jr, Frolenkov GI, Dougherty GW, Kachar B. Espressione di prestin, una proteina di membrana a motore, nel uditivo dei mammiferi e periferia vestibolare. Ascoltate Res. 2003; 184: 27-40. [PubMed] Belyantseva IA, Adler HJ, Curi R, Frolenkov GI, Kachar B. Espressione e localizzazione di prestin e il trasportatore di zucchero GLUT-5 durante lo sviluppo di electromotility nelle cellule ciliate esterne cocleari. J Neurosci. 2000; 20 (24): RC116. [PubMed] Brownell WE, Bader CR, Bertrand D, Ribaupierre Y. evocato risposte meccaniche delle cellule ciliate esterne cocleari isolati. Scienza. 1985; 227: 194-196. [PubMed] Brownell WE, Spector AA, Raphael RM, Popel AS. Micro - e nanomeccanica della cellula capelli esterno cocleare. Ann Rev Biomed Eng. 2001; 3: 169-194. [PubMed] Chambard JM, Harding io, Ashmore JF. Che prestin trasporti. L'Assoc 26 Res Otolaryngol. Incontro annuale; Daytona Beach, FL. 22 febbraio & # x02013; 27; 2003. http://www. aro. org. Dallos P. La coclea attiva. J Neurosci. 1992; 12: 4575-4585. [PubMed] Dallos P, Evans BN, Hallworth R. natura dell'elemento motore in forma cambia elettrocinetiche delle cellule ciliate esterne cocleari. Natura. 1991; 350: 155-157. [PubMed] Flock A, B Flock, Ulfendahl M. meccanismi di movimento in cellule ciliate esterne e una possibile base strutturale. Arch Oto-Rhino-Laryngol. 1986; 243: 83-90. [PubMed] Forge caratteristiche A. strutturali delle pareti laterali in cellule ciliate esterne cocleari mammiferi. Tessuto cellulare Res. 1991; 265: 473-483. [PubMed] Forge A, Zajic G, Li L, G Nevill, Schacht J. variabilità strutturale del sottosuolo cisterne in, isolate cellule ciliate esterne intatte mostrati da marcatura fluorescente delle membrane intracellulari e congelare-frattura. Ascoltate Res. 1993; 64: 175-183. [PubMed] Gale JE, JF Ashmore. Un limite di frequenza intrinseca all'amplificatore cocleare. Natura. 1997a; 389: 63-66. [PubMed] Gale JE, JF Ashmore. Il motore delle cellule dei capelli esterno di membrana. Pflugers Arch. 1997b; 434: 267-271. [PubMed] Hallworth R, Evans BN, Dallos P. La posizione e il meccanismo di electromotility nelle cellule ciliate esterne cavia. J Neurophysiol. 1993; 70: 549-558. [PubMed] Holley MC, Ashmore JF. Spettrina, actina e la struttura del reticolo corticale in cellule cigliate esterne cocleari mammiferi. J cellulare Sci. 1990; 96: 283-291. [PubMed] Holley MC, Kalinec F, Kachar B. Struttura del citoscheletro corticale in cellule ciliate esterne di mammifero. J cellulare Sci. 1992; 102: 569-580. [PubMed] Huang G, Santos-Sacchi J. mappatura della distribuzione della cella capelli sensore di tensione motilità esterno da amputazione elettrica. Biophys J. 1993; 65: 2228-2236. [PMC articolo gratis] [PubMed] Huang GJ, sensore di tensione Santos-Sacchi J. motilità delle cellule ciliate esterne risiede all'interno della membrana plasmatica laterale. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91: 12.268-12.272. [PMC articolo gratis] [PubMed] Kalinec F, Holley MC, Iwasa K, Lim D, Kachar B. Un meccanismo di generazione della forza della membrana a base di cellule sensoriali uditive. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992; 89: 8671-8675. [PMC articolo gratis] [PubMed] Liberman MC, Gao J, Lui DZ, Wu X, Jia S, Zuo J. Prestin è richiesto per electromotility della cella capelli esterno e per l'amplificatore cocleare. Natura. 2002; 419: 300-304. [PubMed] Matsuda K, J Zheng, Du GG, Klocker N, Madison LD, Dallos P. N-linked siti di glicosilazione della proteina prestin motore: effetti su di targeting membrana e la funzione elettrofisiologica. J Neurochem. 2004; 89: 928-938. [PubMed] Oghalai JS, Patel AA, Nakagawa T, Brownell WE. microdeformation della parete laterale delle cellule ciliate esterne fluorescente-immaginata. J Neurosci. 1998; 18: 48-58. [PubMed] Oghalai JS, Zhao HB, Kutz JW, Brownell WE. la mobilità dei lipidi da tensione e tensione-dipendente nella membrana plasmatica delle cellule ciliate esterne. Scienza. 2000; 287: 658-661. [PMC articolo gratis] [PubMed] Ruttiger L, Sausbier M, Zimmermann U, Inverno H, Braig C, Engel J, Knirsch M, Arntz C, Langer P, Hirt B, Muller M, Kopschall io, Pfister M, Munkner S, Rohbock K, Pfaff I, Rusch A , Ruth P, Knipper M. Cancellazione del Ca 2+ - activated di potassio (BK) subunità alfa, ma non il BKbeta1 subunità porta alla perdita progressiva dell'udito. Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101: 12.922-12.927. [PMC articolo gratis] [PubMed] Saito K. Struttura fine dell'epitelio sensoriale della cavia Organo di Corti: sottosuolo cisterne e corpi lamellari nelle cellule ciliate esterne. Tessuto cellulare Res. 1983; 229: 467-481. [PubMed] Santos-Sacchi J, Zhao HB. Eccitazione di coloranti fluorescenti inattiva la proteina integrale prestin motore della membrana delle cellule ciliate esterne e tradisce la sua mobilità laterale. Pflugers Arch. 2003; 446: 617-622. [PubMed] Santos-Sacchi J, Huang GJ, Wu M. mappatura della distribuzione di conduttanze voltaggio-dipendenti delle cellule ciliate esterne da amputazione elettrica. Biophys J. 1997; 73: 1424-1429. [PMC articolo gratis] [PubMed] Weber T, Gopfert MC, Inverno H, Zimmermann U, Kohler H, Meier A, Hendrich O, Rohbock K, Robert D, Knipper M. Espressione di prestin-omologa vettore soluto (SLC26) in organi uditivi di vertebrati non mammiferi e insetti. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100: 7.690-7.695. [PMC articolo gratis] [PubMed] Yu N, Zhu ML, Zhao HB. utilizzo long_term di salicilato upregulates espressione prestin nella coclea cavia. Society for Neuroscience, la 35a riunione annuale; Washington DC. 2005. http://www. sfn. org. Zheng J, Shen W, Egli DZ, lungo KB, Madison LD, Dallos P. Prestin è la proteina del motore delle cellule ciliate esterne cocleari. Natura. 2000; 405: 149-155. [PubMed] Zheng J, Long KB, Shen W, Madison LD, Dallos P. Prestin topologia: localizzazione epitopi proteici rispetto alla membrana plasmatica. NeuroReport. 2001; 12: 1929-1935. [PubMed] Zheng J, lungo KB, Matsuda KB, Madison LD, Ryan dC, Dallos P. genomica caratterizzazione ed espressione di prestin del mouse, il motore di proteine delle cellule ciliate esterne. Mamm Genoma. 2003; 14: 87-96. [PubMed] Zheng J, Du GG, Matsuda K, Orem A, Aguinaga S, Deak L, Navarrete E, Madison LD, Dallos P. Il C-terminale di influenze Prestin non lineare capacità e membrana plasmatica di targeting. J cellulare Sci. 2005; 118: 2987-2996. [PubMed]
